COVID- 19 Laboratorio Miniatura de Pruebas Serológicas usando Microfluídica y Óptica

Fecha: 30 de Septiembre de 2023

La pandemia del COVID-19 que inició a finales del 2019 encontró al mundo fuera de guardia y sin herramientas para el combate de la enfermedad ante la mutación inesperada del virus SARS-COV-2. Nuestro país no fue la excepción, y el sistema de salud fue rebasado tal y como como ocurrió en muchos países del mundo debido a la alta tasa de contagio. Uno de los aspectos claves en condiciones de pandemia es la detección temprana de la infección a escala masiva, así como el seguimiento de su evolución, para poder tomar medidas de salud pública basadas en evidencia.


Investigadores de todo el mundo emprendieron una carrera contrarreloj para desarrollar esas herramientas no disponibles: entre ellas destacan las pruebas PCR y las serológicas. Las primeras (costosas y complejas) son capaces de detectar pequeñas cantidades de virus, incluso en etapas tempranas de la infección. Las segundas (más baratas y rápidas) detectan la reacción del sistema inmune del enfermo, que se defiende del ataque del virus con su ejército de anticuerpos. Quizás el lector recuerde este último tipo de prueba, pruebas individuales similares a las de embarazo, que se venden aún en las farmacias y pueden utilizarse para seguir la evolución de la inmunidad en distintas etapas de la infección. En México, un equipo multidisciplinario de investigadores y técnicos (CIO, CINVESTAV-Monterrey y CICY), desarrolló una tecnología que combina las disciplinas de la microfluídica y la óptica, capaz de detectar la presencia de anticuerpos de COVID-19 en pequeñas muestras de plasma sanguíneo de hasta cincuenta pacientes diferentes de forma simultánea.


El corazón de la tecnología es el chip microfluídico de la Figura 1(a). Se trata de una intrincada red de canales transparentes en los que fluyen tanto las muestras de plasma sanguíneo como reactivos diversos, incluyendo antígenos y marcadores fluorescentes específicos a las proteínas de los anticuerpos afines al virus (S, S1, RBD, N). En la práctica, se trata de capturar a los anticuerpos a través de antígenos específicos en una zona de interés, un biosensor, y “marcarlos” con moléculas fluorescentes. Estas moléculas fluorescentes brillan con una luz ámbar ante una iluminación de mayor energía como el verde o el violeta. Por lo tanto, si se tiene presencia de anticuerpos relacionados con la infección el biosensor brilla, pero sin anticuerpos no habrá luz fluorescente.


Esta tecnología ofrece un verdadero laboratorio de análisis a pequeña escala, ya que el funcionamiento es complejo: de forma resumida, el proceso tiene un alto grado de automatización mediante control de flujos con 500 microválvulas, e incluye etapas de fijación de marcadores en la zona de biosensado, de lavado y enjuague, de inserción de las muestras de plasma para captura de anticuerpos sobre los biosensores, un período de incubación, y posteriormente la detección ópticafinal, para evaluar si las muestras son positivas o negativas a la infección. Esto se observa en la Figura 1(b), donde con apoyo de las microválvulas se forman ya sea cuatro canales horizontales donde fluyen de forma separada los antígenos (S, S1, RBD, N) y moléculas fluorescentes, o cincuenta canales verticales para evaluar el suero del mismo número de pacientes simultáneamente.


Para validar la efectividad del chip microfluídico se realizaron pruebas en sueros de pacientes extraídos previo a la pandemia y de pacientes infectados durante la pandemia de COVID-19. Como se observa en la Figura 1(c), en el caso de pacientes con COVID-19 los cuatro biosensores brillan con diferentes intensidades, pero en los sueros pre pandemia únicamente el sensor para anticuerpo S se ilumina ligeramente. Esta discriminación nos permite detectar eficientemente entre pacientes con y sin COVID-19 [1]. La intensidad de la luz ámbar de interés puede llegar a ser muy tenue a bajas concentraciones de anticuerpos (lo que ocurre, por ejemplo, en etapas tempranas de la infección o semanas después de la remisión), por lo que se requiere de un instrumento de alta sensibilidad para detectarla: un microscopio de fluorescencia invertido. Este dispositivo, disponible a nivel comercial, suele ser muy caro y de gran tamaño, por lo que no se considera portátil, y su uso se restringe a laboratorios especializados y de investigación.


Para contar con un sistema portátil y de bajo costo se desarrolló un microscopio que, aunque no tuviera todas las prestaciones de un microscopio comercial, funcionara eficientemente para identificar la fluorescencia emitida por el biosensor de igual forma que el microscopio comercial.



Fig. 1 (a) Chip microfluídico para pruebas serológicas COVID-19, (b) Operación esquemática de los biosensores, y (c) Resultados de fluorescencia en sueros con diferente carga de anticuerpos obtenidas en microscopio de fluorescencia comercial.


Nuestro diseño se basa en el esquema estándar de microscopio de fluorescencia invertido en donde un haz de excitación (apuntador láser a 532 nm) se enfoca sobre la muestra (biosensor), y la fluorescencia emitida es separada por filtros dicroicos que bloquean el haz de excitación y dejan pasar la fluorescencia hacia la cámara (Raspberry de 12.3MPix). La diferencia principal en nuestro diseño es que no utilizamos objetivo de microscopio (magnificación fija en cada objetivo), sino que utilizamos una lente compuesta estándar de 35mm ya que permite obtener una mejor relación entre la magnificación y un mayor campo de visión. Además, con el uso de espaciadores podemos controlar fácilmente la distancia focal y por ende la magnificación del microscopio. La estructura mecánica con el esquema óptico se muestra en la Figura 2(a), el cual se caracterizó utilizando una computadora externa.


Posteriormente se integró toda la electrónica, incluyendo una Raspberry Pi 3 y un Arduino UNO, que permiten controlar de forma autónoma la evaluación del chip microfluídico tal como se muestra en la Figura 2(b). Finalmente, como se muestra en la Figura 2(c), se integraron cubiertas y tapa superior para su acabado final. La magnificación alcanzada, como se muestra en la Figura 2(d), es suficiente para evaluar cada biosensor de forma individual.


La validación final del microscopio se realizó al evaluar sueros con diferente carga de anticuerpos, y comparar la medición de estos mismos sueros en el microscopio comercial. La intensidad de la fluorescencia medida con el microscopio comercial disminuye conforme cambiamos de una muestra con alta, media y baja concentración de anticuerpos, ver Figuras 2(e), (f) y (g) respectivamente. La medición de estos sueros en nuestro microscopio muestra una variación en intensidad similar, ver Figura 2(h), (i) y (j), y aunque se tiene un ligero brillo de fondo se distinguen claramente los sueros con diferentes niveles de anticuerpos.


1. A high-throughput multiplexed microfluidic device for COVID-19 serology assays, R. Rodriguez-Moncayo et.al., Lab Chip, 2021, 21, 93 DOI: 10.1039/D0LC01068E



Fig. 2 (a) Estructura mecánica con el arreglo óptico integrado, (b) Componente electrónicos integrados en el microscopio para operación autónoma, (c) Prototipo final del microscopio desarrollado, (d) Imagen de un biosensor obtenida con nuestros microscopio, (e)-(g) Fluorescencia obtenida con microscopio comercial para diferentes concentraciones de anticuerpos, y (h)-(j) Fluorescencia obtenida con nuestro microscopio para las concentraciones de sueros anteriores